Badanie wykonuje się po odpowiednim przygotowaniu, polegającym na oczyszczeniu z resztek pokarmowych jelita najczęściej za pomocą doustnie podawanych środków przeczyszczających, wspomaganych przez wlewy lub wlewki doodbytnicze. Przygotowanie rozpoczyna się w przeddzień zabiegu, kiedy chory musi powstrzymać się od jedzenia i picia innych płynów niż służące do oczyszczenia jelita. W rzadkich przypadkach, ze względu na stan ogólny pacjenta uniemożliwiający tego typu przygotowanie, czyszczenie jelita polega na kilkudniowej głodówce, połączonej z licznymi doodbytniczymi wlewami czyszczącymi. Samo badanie wykonywane jest przy zastosowaniu giętkiego kolonoskopu, który wprowadza się przez odbyt do jelita grubego. Zabieg może być okresami bolesny. Ewentualny ból trzeba odróżniać od stale występującego wzdęcia wynikającego z podawania powietrza do światła jelita. Dla jego pełnej oceny należy ból zgłosić lekarzowi, a jego stałe utrzymywanie się może być wskazaniem do odstąpienia od dalszej oceny jelita.

Instrument służący do kolonoskopii jest specjalnie dezynfekowany przed każdym badaniem, dlatego też zainfekowanie jest praktycznie niemożliwe. W razie potrzeby pobiera się ze zmian chorobowych wycinki do oceny histopatologicznej. Służą do tego sterylne szczypczyki, co również chroni przed zakażeniem.